表观遗传学平台

重庆生命知源科研课题实验外包平台中表观遗传学是指表观遗传学改变(DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等)对表观基因组基因表达的调节。
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产品概述

表观遗传学平台
       表观遗传学是指表观遗传学改变(DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等)对表观基因组基因表达的调节,这种调节不依赖基因序列的改变且可遗传。
       生命知源致力于MSP(甲基化特异性PCR法)、BSP(亚硫酸氢钠处理后测序法)、WGBS(全基因组甲基化测序)、ChIP、MeDIP(甲基化DNA免疫沉淀法)、RIP、m6A、双荧光素酶基因报告等科研技术服务,结合多年项目管理及实施经验,可以为您提供整套优质的表观遗传学项目服务,助力您的表观遗传学研究取得更大进步。
 
1. MSP/BSP
        MSP其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,未甲基化的胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不变,基于这种碱基的改变,然后根据甲基化位点设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息。
       BSP的基本原理是⽤亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发⽣甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U),⽽甲基化的胞嘧啶不变。随后再CpG岛两端设计引物进⾏PCR,将⽬的产物纯化后进⾏TA克隆,每个克隆挑取阳性克隆测序,最后将测得的序列与原始序列⽐对,统计甲基化位点及数量,并分析甲基化程度。BSP则可以详细了解每一个CpG位点的甲基化情况。

项目原理图:
 
项目流程:
基因组DNA提取并定量→亚硫酸氢钠修饰→DNA修饰纯化后回收→引物设计合成→PCR检测→琼脂糖凝胶电泳(MSP)/产物克隆测序(BSP)
 
2. WGBS
        WGBS(Whole-genome bisulfite sequencing)原理是用Bisulfite(亚硫酸氢盐)处理,将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来,再结合高通量测序技术,与参考序列比对,特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

项目优势:
单碱基分辨率:精确分析每一个C碱基的甲基化状态
准确性和可靠性高:有效定量表达水平跨越6个数量级的转录本丰度
检测范围广:一次可获得数百万条序列

项目流程
基因组DNA提取并定量→亚硫酸氢钠修饰→测序文库构建→测序及数据质控→数据分析

样本要求:
≥ 10ug DNA 样本;OD260/280值在1.8~2.0 之间;保证基因组无降解,浓度≥100 ng/μL。样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,低温寄送样品或干冰邮寄。
 
3. ChIP
       ChIP是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。其原理是在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。

项目原理图:

项目流程
细胞固定→染色质断裂→染色质免疫沉淀→交联反应的逆转→DNA的纯化→PCR/qPCR/测序或芯片检测
 
4. MeDIP
        MeDIP是一种高效富集甲基化DNA的方法。在该方法中,可与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中,从而使甲基化的基因组片断免疫沉淀,形成富集。通过与已有DNA微芯片技术/高通量测序相结合,从而进行大规模DNA甲基化分析。该方法简便,特异性高,适合DNA甲基化组学(DNA Methylome)的分析。

项目原理图
 
项目流程
细胞固定→染色质断裂→5mC抗体免疫沉淀→甲基化DNA富集纯化→测序或芯片检测
 
5. RIP
       RIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。

项目原理图
 
项目流程
细胞交联固定→染色质DNA消化降解→目标蛋白的抗体免疫沉淀→解交联并富集纯化RNA→PCR、测序或芯片检测
 
6. m6A
      RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上,而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是最为普遍的修饰。目前发现miRNA,circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上,其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定。
       已知绝大部分真核生物中,mRNA 5’UTR区域发生的甲基化修饰,在mRNA剪接、编辑、稳定性、降解、多腺苷酸化等方面发挥重要功能;而3’UTR区域发生的甲基化修饰有助于mRNA的出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定。

 
项目研究方向
①主要是通过研究 m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能,进而研究m6A修饰的生物学功能和作用机制。
②m6A修饰图谱构建及作用机制:通过m6A甲基化测序(MeRIP-Seq, miCLIP)构建疾病细胞模型或者发病组织的 m6A 修饰谱。
项目流程
RNA提取定量→磁珠富集→RNA片段化→m6A抗体免疫沉淀→甲基化RNA富集纯化→常规建库并测序
 
7. 双荧光素酶报告基因
       双荧光素酶报告基因检测是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光,可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光,常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等方向研究。
       海肾荧光素酶报告基因载体phRL具有海肾荧光素酶报告基因,能高水平表达海肾荧光素酶基因。可作为检测转染频率的内对照,使实验值可以规一化。

项目原理图
 
 
项目流程
启动子或MiR结合位点序列获取→质粒构建→共转染→荧光值检测→数据规一化处理

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